大蛇丸是被佐助杀死的。

在334集的时候，大蛇丸想要佐助的身体，所以佐助要动手杀他，但最后大蛇丸在自己制造的空间里侵噬了佐助，就在大蛇丸转身的时候，佐助利用自己的写轮眼，反侵噬了大蛇丸，然后把大蛇丸的力量夺了去。大蛇丸被佐助杀死之后，佐助把大蛇丸的所有都拿走了，包括他的忍术，白蛇的力量等。